بررسی نقش پروتئین cagl هلیکوباکتر پیلوری عرضه شده بر روی سطح اسپورهای باسیلوس سوبتیلیس در القاء بیان il-8، -tnf-αو اینتگرینα5β1 در رده سلولی ags

سویه¬های بیماری¬زای هلیکوباکتر پیلوری حامل لوکوس cagpai کد کننده ساختار پیلوس سرنگ مانند به نام سیستم ترشحی تیپ چهار می¬باشند که با التهاب شدید اپیتلیوم معده مرتبط است. پروتئین حفاظت شده cagl بر روی نوک ساختار پیلوس سیستم ترشحی تیپ چهار قرار دارد و حاوی موتیف آرژنین-گلایسین-آسپارتات (rgd) است که جهت اتصال به گیرنده اینتگرین α5β1 برای انتقال caga از ورای غشا سلولی میزبان ضروری می¬باشد. امروزه اندوسپورهای باکتریال و خصوصاً لایه پوشش اسپور باسیلوس سوبتیلیس بطور گسترده به عنوان سکوی نمایش پروتئین¬های هترولوگ و آنزیم¬ها به دلیل بی خطر بودن و مقاومت بالای آنها به شرایط محیطی سخت استفاده می¬شوند. هدف اصلی مطالعه حاضر بررسی نقش احتمالی پروتئین cagl و تنوع آن در القا پاسخ¬های پیش التهابی شامل ترشح سیتوکین¬های il-8 و tnf-α در رده سلولی سرطانی معده ags با استفاده از سیستم نمایش بر روی سطح اسپور باسیلوس سوبتیلیس می¬باشد. ایزوله¬های بالینی هلیکوباکتر پیلوری از کشت بیوپسی¬های معده 126 بیمار با علائم گاسترودئودنال مختلف بدست آمد. آنالیز ژنوتایپینگ بر اساس pcr برای بررسی حضور ژن¬های ویرولانس شامل ژن¬های cagl، caga، vaca s1/s2، vaca m1/m2، icea1/a2، baba2 و saba با استفاده از پرایمرهای اختصاصی انجام شد. آنالیز پلی¬مورفیسم واریانت¬های ژن cagl ایزوله¬های بدست آمده با استفاده از روش تعیین توالی مبتنی بر pcr انجام گرفت. دو واریانت ژن cagl (oc975 و oc824) جهت کلونینگ در وکتور اینتگریتیو pdg1662 باسیلوس سوبتیلیس انتخاب شدند، تا بر روی سطح لایه پوشش خارجی اسپور باسیلوس سوبتیلیس با استفاده از اشکال با طول کامل و کوتاه شده ژن cotb پوشش خارجی اسپور به عنوان ژن حامل تحت پروموتور cotb بیان شوند. نمایش سطحی فیوژن پروتئین¬های هترولوگ با استفاده از روش¬های sds-page، ایمنوبلاتینگ، میکروسکوپ ایمنوفلورسنس و فلوسیتومتری ارزیابی گردید. القا ترشح il-8 و tnf-α و بیان اینتگرین α5β1 با استفاده از کشت همزمان اسپورهای نوترکیب عرضه کننده واریانت¬های منتخب پروتئین cagl با رده سلولی ags طی 6 ساعت پس از عفونت بترتیب با روش¬های الایزا و quantitative real-time rt-pcr بررسی شدند. نتایج با نرم افزار spss ورژن 21 آنالیز گردید و p < 0.05 از نظر آماری معنادار در نظر گرفته شد. در مجموع، 61 (48%) سویه هلیکوباکتر پیلوری از بیماران مطالعه حاضر ایزوله شد. ژن¬های cagl، caga، vaca s1/s2، vaca m1/m2، icea1/a2، baba2 و saba بترتیب در 96/7، 85/2، 75/4، 24/6، 29/5، 70/5، 42/6، 23، 96/7 و 83/6% ایزوله¬ها شناسایی شدند. ارتباط معناداری از نظر آماری بین ژنوتیپ¬های اشاره شده و بیماری¬های گاسترودئودنال مشاهده نگردید (p > 0.05). آنالیز پلی¬مورفیسم اسیدهای آمینه cagl نشان داد که موتیف rgd این پروتئین کاملاً در میان ایزوله¬های ما حفاظت شده است. نمایش سطحی فیوژن پروتئین¬های هترولوگ شامل cotb-cagl با طول کامل و کوتاه شده بر روی سطح اسپورهای باسیلوس سوبتیلیس با استفاده از روش¬های فوق تائید گردید. القا قابل توجه ترشح il-8 و tnf-α توسط اسپورهای نوترکیب عرضه کننده واریانت¬های cagl در مقایسه با اسپورهای غیر نوترکیب توسط آزمون الایزا سوپرناتانت¬های کشت سلولی 6 ساعت بعد از عفونت مشاهده شد. سطح بیان اینتگرین α5β1 نیز به میزان کمی 6 ساعت بعد از عفونت توسط اسپورهای نوترکیب افزایش یافت. تفاوت¬های معناداری در القا ترشح il-8 و tnf-α و بیان اینتگرین α5β1 بین واریانت¬های منتخب cagl و همچنین بین فیوژن پروتئین¬های عرضه شده در اشکال با طول کامل و کوتاه شده پروتئین cotb مشاهده نشد. التهاب مزمن اپیتلیوم معده شاخص اصلی عفونت هلیکوباکتر پیلوری در اکثر افراد کلونیزه شده با این باکتری می¬باشد، که پیامدهای بالینی بیماری¬های مرتبط را تحت تاثیر قرار می¬دهد. نقش سیستم ترشحی تیپ چهار کد شده توسط cagpai و اجزای آن در القا پاسخ¬های پیش التهابی همواره مورد بحث بوده است. نتایج مطالعه ما پیشنهاد کننده نقش احتمالی پروتئین cagl سیستم ترشحی تیپ چهار به عنوان یک القاگر قوی التهاب شدید در سلول¬های اپیتلیال معده می¬باشد. علاوه براین، واسطه¬گری اینتگرین α5β1 در این مسیر سیگنالینگ پیش التهابی به دلیل میانکنش مستقیم آن با پروتئین cagl پیشنهاد می¬گردد.